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益生菌诱导合成金属硫蛋白以及对自由基清除率和安全性实验
  作者:山东宝来利来股份有限公司研究院 摘自:中国饲料工业信息网 日期:2013-10-09  

 

 

摘要:金属硫蛋白能清除体内过多的自由基,从而起到抗氧化,抗应激的作用。(目的)本文旨在介绍一种用益生菌诱导合成金属硫蛋白的方法,并看其对羟自由基和氧自由基的清除率和在动物体中的安全性。(方法)本实验通过对产朊假丝酵母用2.0 mmol/l CuCl2 进行诱导之后,经超声波进行破碎用结晶紫分光光度法和AP-TEMED法测定对羟自由基和氧自由基的清除率。并用小白鼠通过灌胃的方法观察此法诱导合成的金属硫蛋白对动物体的安全性。(结果)结果显示,产朊假丝酵母合成的金属硫蛋白对羟自由基和氧自由基有很好的清除作用,分别达到了91.75%83%。通过用小白鼠进行安全性实验证明此法诱导合成的金属硫蛋白安全无毒副作用,并且对增重还有一定的效果。(结论)从上述结果可以看出,产朊假丝酵母合成的金属硫蛋白可以很好的清除体内过多的自由基,防止过多的自由基对内脏造成的损伤,保证动物机体的健康和正常的生产性能。

关键词:金属硫蛋白;产朊假丝酵母;抗应激

金属硫蛋白(metalbthionein,简称MT)是一类广泛存在于生物体中的低分子量、富含金属和半胱氨酸,且能被金属或其他因素诱导生成的金属结合蛋白。自1957年美国哈佛大学的MarsgoshesVallee从马肾中首次发现MT以来,人们对不同来源的MT进行了系统的研究(张博润等,1999)MT的生物学意义涉及生物机体微量元素贮存运输和代谢、重金属解毒、拮抗电离辐射、清除自由基以及机体生长发育、生殖衰老、肿瘤发生、免疫应激反应等各个方面,其研究涉及农业、医药保健、生物工程、环境保护等各个领域(Vallee B L1991)。以往获得金属硫蛋白的方法通常是用动物或是特定的植物,通过对动物饲喂含有金属元素的诱导剂,或是用含有金属元素的培养液种植植物,使这些动物或植物体内在诱导剂的作用下产生金属硫蛋白,再通过对动物进行屠宰从中获得含有金属硫蛋白的内脏,或是从植物的茎叶中提取金属硫蛋白。徐丽霞等就是通过给兔子饲喂诱导剂之后从兔子的肝脏中分离纯化MT(徐丽霞,2002)。湖南农业大学的李小龙通过对三元杂交猪饲喂硫酸锌,从其肝脏中提取金属硫蛋白(李小龙,2003)。但是,这些方法最大的弊端就是过程复杂而且周期很长,最后得到的金属硫蛋白的量也是很少的,造成其生产成本很高,价格昂贵,有报道以传统的屠宰动物从内脏提取金属硫蛋白成本为每克1000元左右,市场价格为每克3000元左右(猪肝金属硫蛋白的提取技术,新产品新技术)。所以如此高昂的成本使得金属硫蛋白无法大量用于生产实践中。近年来,有学者发现通过用适当的诱导剂在一定的条件下诱导酵母菌可以使之在胞内合成MT,但是在酵母菌的56个属中只在酵母属、裂殖酵母属、假丝酵母属3个属l0余个种中有MT的报道(李福荣等)通过诱导后的酵母菌再经过一定的方法破碎、提取和纯化得到MT,则可以大大的缩短生产的周期,以低廉的成本获得大量的MT,使之能大范围的推广,更重要的使之能最为饲料添加剂在养殖业中广泛使用。

1.金属硫蛋白诱导发酵工艺

1.1材料:

1.1.2产脘假丝酵母由本公司菌种保藏中心提供。

1.1.3培养基:葡萄糖,酵母膏,蛋白胨,磷酸二氢钾。

1.1.4 超声波破碎缓冲液为0.01mol/l Tris-HClpH8.6

1.2诱导方法:

首先将斜面培养基中的菌种接种到酵母菌培养基中活化,然后将活化好的菌液按照一定比例接种到加有诱导剂的酵母培养基中, 在摇床中进行培养。

1.3 工艺参数

诱导菌种:产朊假丝酵母

诱导剂: CuCl2

诱导剂浓度: 2.0 mmol/l

培养基:G1.5%,蛋白胨1%,酵母膏0.5%KH2PO40.2%,自然pH

接种量:2.5%

通气量:实验中三角瓶装量为50/500ml,发酵罐生产中需要较大的通气量

发酵时间:22小时

发酵温度:30

发酵转速:140rpm/min

2. 酵母破碎以及金属硫蛋白粗提

2.1 实验材料与方法

金属硫蛋白由产脘假丝酵母经特定的诱导剂诱导后合成MT,并经过超声波破碎后用0.01mol/l Tris-HCl进行粗提,得到含有金属硫蛋白粗品的缓冲液。

2.2 超声波破碎方法:

1)讲经过诱导培养基培养后的菌液5000r/min离心20min

2)用0.01mol/l Tris-HCl清洗离心得到的沉淀,并重复2~3次。

3)用沉淀两倍体积的0.01mol/l Tris-HCl重悬清洗过的沉淀。

4)用超声波破碎仪对菌种进行破壁,并30℃恒温振荡30分钟后在70℃水浴5分钟。

55000r/min离心20min两次,取上清液为含金属硫蛋白粗品缓冲液。

3.金属硫蛋白对自由基清除率测定

3.1材料

1 mol/lHClTrisTEMED,过硫酸铵,FeSO4H2O2,结晶紫,1-萘胺,对氨基苯磺酸。

3.2 测定方法

羟自由基和氧自由基清除率测定分别采用结晶紫分光光度法(萧华山等,1999)和AP-TEMED法(刘骏,2005)。

3.3测定结果

 

金属硫蛋白对自由基的清除率

Table 1 metallothionein radical scavenging rate

 

 

清除率

平均值

羟自由基

93%

90%

91%

93%

91.75%

氧自由基

82%

80%

86%

84%

83%

从表1中可以看出MT缓冲液对氧自由基和羟自由基有很好的清除作用, 而且MT对于羟自由基的清除效果要好于氧自由基。

4.金属硫蛋白安全性实验

4.1实验动物

实验用的小白鼠为18-20g的雌性小鼠,购自泰安泰邦生物公司。

4.3实验设计

小鼠经过一周的饲喂进行分组。小白鼠随机的分为对照组(I)生理盐水组(II)和实验组(III,IVV),每组四只,每天灌胃一次。三个实验组灌胃所用的溶液是20%60%100%MT缓冲液和蒸馏水的混合液,小鼠在饲喂1周、2周和3周后进行屠宰。

4.3 实验结果

4.3.1 小鼠平均体重(g

 

2  小鼠平均体重

Table 1  Mice average body weight

 

第一周

第二周

第三周

生理盐水组

26.45±1.02a

28.4±1.34a

31.3±0.56a

Tris-HCl组

27.1±1.33a

28.4±0.67a

30.5±1.83a

20%提取液组

27±0.23a

28.4±0.28a

30.5±0.62a

60%提取液组

27.7±0.37a

29.8±1.03a

33±0.39a

100%提取液组

28.2±0.96a

29.7±1.21a

32±0.78a

有一个字母相同的为差异不显著(P0.05),两个字母全部相同的为差异显著P<0.05

A letter thesame as the difference was not significant (P>0.05), all of the same two letters as the difference significant (P <0.05).

4.3.2 小鼠脏器平均增重(g

  3  小鼠平均脏器平均增重

Table 1  Average weight of average organ in mice

 

I(对照组)

I (Control group)

II(生理盐水组)

II (The physiological saline group)

III20%MT混合液)

III20%MT mixture

IV60%MT混合液)

IV60%MT mixture

V100%MT混合液)

V1000%MT mixture

心脏平均重

The average weight of heart

0.19±0.01a

0.1667±0.015a

0.2133±0.023a

0.1733±0.009a

0.2233±0.024a

肝脏平均重

The average weight of live

1.69±0.061a

1.3067±0.057b

1.5300±0.110ab

1.49±0.077ab

1.37±0.068b

脾脏平均重

The average weight of spleen

0.1±0.006a

0.1±0.015a

0.1267±0.047a

0.1233±0.043a

0.1033±0.009a

肺脏平均重

The average weight of lungs

0.2233±0.012a

0.18±0.036a

0.1967±0.007a

0.2067±0.016a

0.1933±0.013a

肾脏平均重

The average weight of kidney

0.4433±0.043a

0.3767±0.041ab

0.3667±0.038ab

0.3667±0.003abm

0.35±0.011b

平均体温(℃)

37.5±0.203a

38.5±0.284b

37.2±0.219a

36.7±0.404a

37±0.058a

有相同字母的为差异不显著(P0.05),没有相同字母的为差异显著P<0.05

The same letter no significant difference (P > 0.05), no same letters differ significantly (P < 0.05).

从表2、表3中可以看出三个实验组(IIIIVV)和生理盐水组之间的脏器增重,体重差异不显著P<0.05V100%MT)混合液的肝脏增重和肾脏增重与对照相比差异显著(P0.05),可能是由于过高的剂量加重了肝脏和肾脏的分解和排泄的负担所造成,而其他剂量对小白鼠没有影响。 

讨 论

在实验的三周中,小白鼠的体温保持正常,体重增重平稳,没有因为病变而死亡的小白鼠,最后解剖时未发现有脏器病变的情况。所以,可以看出金属硫蛋白对动物体没有毒副作用,有良好的安全性。同时,从每周对小白鼠体重的测量中还可以看出,随着浓度的增加,小白鼠的体重有上升的趋势。说明金属硫蛋白可以调节动物机体营养物质的的代谢,尤其是一些微量元素的代谢比如锌的代谢,而很多酶活性的高低都与金属微量元素的含量有关有关。促进了这些微量元素的代谢的同时也提高了各种酶的活性,从而提高了动物机体对营养物质的吸收和利用。

结 论

通过对产脘假丝酵母用特定浓度的诱导剂进行诱导发酵之后,使产朊假丝酵母在诱导剂的作用下合成金属硫蛋白,解决了传统方法成本高、产量小的的弊端。同时,产朊假丝酵母合成的MT对羟自由基和氧自由基有很好的清除作用,分别达到了91.75%83%。通过用小白鼠进行安全性实验证明此法诱导合成的金属硫蛋白安全无毒副作用,并且对增重还有一定的效果。

综上所述,通过产朊假丝酵母诱导合成金属硫蛋白可以大大的降低金属硫蛋白的成本,提高金属硫蛋白的产量,使金属硫蛋白能广泛的应用于畜牧业中,防止由于各种应激尤其是热应激产生大量的自由基而对动物机体造成的损伤,调控动物机体营养物质的代谢(吴力专,2005)。保证家畜的健康和生产性能,提高家畜的繁殖力(陈海燕等,2008)保证牧场的经济效益。

参考文献略

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