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基因工程乳酸菌对肉鸡免疫性能及肠道菌群的影响
  作者:山东宝来利来生物工程股份有限公司 摘自:中国饲料工业信息网 日期:2013-10-09  

摘要:本试验旨在探讨基因工程乳酸菌对肉鸡免疫性能、肠道菌群的影响。试验选取3301日龄的AA肉雏鸡,随机分为处理组、阴性对照组和空白对照组,处理组饲喂基因工程乳酸菌冻干菌粉,饲喂基因工程乳酸菌喷干菌粉,饲喂灭活大肠杆菌菌悬液。结果表明:基因工程乳酸菌对肉鸡法氏囊和脾脏的发育有促进的作用,对大肠杆菌引起的肝毒性有一定的保护性,其中尤以基因工程乳酸菌喷干粉试验组(2×106cfu/g)效果较为明显。28日龄时,基因工程乳酸菌喷干粉试验(2×106cfu/g)脾脏指数显著高于空白组和阴性对照组,分别高出80%63.6%,法氏囊指数效果显著高于阴性对照组组,高出46.7%。同时基因工程乳酸菌可以在一定程度上抑制直肠和盲肠中大肠杆菌的增殖,并且在肉鸡成长的前期对盲肠和直肠乳酸菌的数量具有一定的保护作用,但持续作用时间较短,不如大肠杆菌灭活疫苗的效用持久。

关键词:基因工程乳酸菌;肉鸡;免疫性能;肠道微生物菌群

乳酸菌是人体和动物肠道中必不可少的且具有重要生理功能的益生菌,是最优势的益生菌之一。乳酸菌菌体本身就对机体有益生作用,其分泌多种物质更是机体必不可少的,若再在其载体上克隆入外源目的基因,就可集菌体、自泌物质和外源蛋白于一体[1]。以乳酸菌作为基因工程受体菌,利用基因工程技术有目的、有选择地表达有价值的抑菌素、酶、次级代谢产物等,从而将其作为安全的疫苗载体,分泌表达多种治疗性蛋白和免疫抗原,刺激机体的免疫应答,以便更好地控制其参与食品加工、医疗保健的过程。通过改造乳酸菌使其更适合人体和动物的需要,再制成微生态制剂和活菌疫苗等保健品或药品,是当今乳酸菌分子生物学研究的一个重要方向[2]。本实验旨在研究基因工程乳酸菌作为微生态制剂对肉鸡免疫性能和肠道菌群的影响。

1材料与方法

1.1实验材料

基因工程乳酸菌冻干菌粉(1.27×1010 cfu/g),喷干菌粉(2.1×109cfu/g),灭活大肠杆菌菌悬液(2×108cfu/g),由本实验室制备。

实验动物:3301日龄的AA肉雏鸡,购自泰安市东岳种禽公司;全价饲料购自天普阳光

1.2试验设计及饲养管理

1.2.1试验设计

3301日龄健康AA肉鸡随机分为处理组、阴性对照组和空白对照组,处理组包括饲喂基因工程乳酸菌冻干菌粉试验组(),基因工程乳酸菌喷干菌粉试验组(),灭活大肠杆菌菌悬液试验组(),分别包括高、中、低剂量组,浓度为2×1062×1052×104cfu/ml,每组3个重复,每个重复10只鸡。饮水使用。

1.2.2饲养管理

   试验期42天,试验鸡分笼饲养,自由采食和饮水。舍内温度、湿度和光照严格按照常规饲养管理要求进行,按常规免疫程序对肉鸡进行新城疫免疫和法氏囊免疫。1421日龄实验组和阴性组腹腔注射活大肠杆菌菌悬液4×109cfu/ml2835日龄腹腔注射活大肠杆菌菌悬液4×1010cfu/ml。每日喂水喂料前都要对水槽和料槽进行清洗消毒。试验期间详细记录各组饲料消耗和鸡的健康状况。

1.3样品采集及检测指标

1.3.1免疫器官指数的测定

分别于142842日龄从每个重复随机取3只鸡,颈动脉放血处死,无菌解剖,摘取脾脏、法氏囊、肝脏,用滤纸吸取表面的血和水分,剔除脂肪后,用电子天平称鲜重,根据与宰前活重之比计算脾脏指数、法氏囊指数和肝脏指数。

免疫器官指数(mg/g)=免疫器官指数/活体重

1.3.2肠道菌群的测定

分别于142842日龄从每重复中随机抽取3只鸡,称重后经静脉放血宰杀,通过无菌手术采集直肠、盲肠中段内容物各1g,将样品搅拌均匀,用无菌生理盐水的三角瓶里,在漩涡均匀器上充分振摇,使样品均匀分散,采用平板培养计数法计数肠道乳杆菌和大肠杆菌。 菌群数量以每克肠道内容物所含细菌群落总数的对数[( lgCFU) /g]表示。

1.4数据处理

试验数据采用SPSS13.0 进行统计,采用One-way ANOVA 进行方差分析,LSD 法进行组间多重比较,结果均以平均数±标准差表示。

2结果与分析

2.1基因工程乳酸菌对免疫器官指数的影响

基因工程乳酸菌对肉鸡脾脏指数的影响(单位:mg/g

日龄(d)

组别

空白

14

0.08±0.01ab

0.09±0.01ab

0.09±0.004ab

0.08±0.01ab

0.08±0.004ab

0.07±0.01ab

0.12±0.05b

0.06±0.004a

0.08±0.01ab

0.08±0.01ab

0.07±0.01ab

28

0.09±0.01a

0.13±0.03a

0.10±0.01a

0.18±0.04b

0.14±0.07b

0.1±0.03ab

0.11±0.21a

0.13±0.03a

0.12±0.05a

0.11±0.018a

0.1±0.01a

42

0.11±0.01

0.13±0.01

0.17±0.03a

0.15±0.02

0.14±0.02

0.16±0.02

0.13±0.03

0.13±0.01

0.18±0.02a

0.13±0.02

0.14±0.02

注:同行同一日龄阶段数据肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05),肩标相同小写字母或无字母表示差异不显著(P >0.05)。

由表1可看出,14日龄时,各试验组脾脏指数均与对照组差异不显著(P0.05)28日龄时,组脾脏指数显著高于空白组和阴性组(P0.05),分别高出80%63.6%组脾脏指数显著高于空白组和阴性组(P0.05),分别高出40%27.2%,总体看来,在提高肉鸡脾脏指数方面,组的效果较明显,即组的基因工程乳酸菌喷干粉添加量较适宜。

基因工程乳酸菌对肉鸡法氏囊指数的影响(单位:mg/g

日龄(d)

组别

空白

14

0.15±0.02

0.17±0.01

0.16±0.01

0.15±0.01

0.17±0.02

0.17±0.01

0.15±0.02

0.14±0.01

0.17±0.01

0.13±0.01

0.16±0.01

28

0.15±0.02a

0.13±0.02a

0.17±0.01ab

0.22±0.04b

0.16±0.02ab

0.16±0.01ab

0.13±0.02a

0.17±0.02ab

0.14±0.02a

0.15±0.02a

0.18±0.02ab

42

0.05±0.01a

0.07±0.02ab

0.07±0.01ab

0.08±0.02abc

0.05±0.004a

0.1±0.01bc

0.09±0.01abc

0.07±0.01ab

0.07±0.01ab

0.12±0.03c

0.09±0.02abc

注:同行同一日龄阶段数据肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05),肩标相同小写字母或无字母表示差异不显著(P >0.05)。

2可以看出,14日龄时,各试验组法氏囊指数均与对照组差异不显著(P0.05)28日龄时,组与空白对照组差异不显著(P0.05),但效果较好于空白对照组,并且好于阴性对照组,高出46.7%,差异显著(P0.05)均与空白对照组差异不显著(P0.05),但效果好于阴性对照组。总体看来,组能相对的提高肉鸡法氏囊指数,效果较明显。

基因工程乳酸菌对肉鸡肝脏指数的影响(单位:mg/g

日龄(d)

组别

空白

28

3.02±0.07ab

2.81±0.1ab

3.17±0.2ab

2.68±0.18a

3.2±0.22ab

2.91±0.73ab

3.18±0.25ab

2.87±0.14ab

3.19±0.18ab

3.29±0.016b

2.78±0.04ab

42

2.67±0.2a

2.89±0.07a

3.03±0.16a

3.08±0.25a

2.96±0.08a

3±0.15a

2.81±0.13a

3±0.16a

4.2±0.12b

2.75±0.2a

3.09±0.22a

注:同行同一日龄阶段数据肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05),肩标相同小写字母或无字母表示差异不显著(P >0.05)。

由表3看出,28日龄时,组肝脏指数显著低于阴性对照组(P0.05),与空白对照组差异不显著(P0.05),说明基因工程乳酸菌对大肠杆菌引起的肝毒性有一定的保护性。42日龄时,组与其他各组均差异显著(P0.05),其余各组间差异不显著(P0.05)。结果表明,该基因工程乳酸菌的浓度不是越大越好,而且喷干组效果较其它组较好。

2.2基因工程乳酸菌对肉鸡盲肠乳杆菌和肠杆菌的影响

基因工程乳酸菌对肉鸡盲肠乳酸杆菌和大肠杆菌数量的影响( lgCFU) /g

组别

乳酸杆菌

大肠杆菌

14日龄

28日龄

42日龄

14日龄

28日龄

42日龄

8.51±0.13

9.05±0.16a

8.66±0.09a

9.14±0.11

7.92±0.23a

7.55±0.13a

8.56±0.17

9.15±0.17a

8.68±0.10a

8.81±0.19

8.29±0.22a

8.39±0.06a

8.46±0.02

9.02±0.06a

8.65±0.20a

8.82±0.09

7.91±0.14a

8.44±0.08a

8.58±0.03

8.92±0.21a

8.61±0.23a

9.26±0.06

8.59±0.17b

8.7±0.20b

8.65±0.09

8.98±0.18a

8.72±0.16a

9.2±0.12

8.72±0.19b

8.64±0.18b

8.61±0.14

8.97±0.13a

8.63±0.18a

9.1±0.21

8.77±0.16b

8.54±0.17b

8.49±0.17

8.60±0.26b

9.17±0.22c

8.88±0.17.

8.96±0.08bc

9.0±0.14c

8.52±0.09

8.56±0..08b

9.23±0.13c

8.78±0.15

8.9±0.07bc

8.94±0.16c

8.46±0.06

8.52±0.06b

8.92±0.02c

9.13±0.06

8.76±0.11b

9.1±0.21c

8.45±0.02

8.50±0.19b

8.46±0.06b

8.8±0.08

8.95±0.21bc

8.88±0.09bc

空白

8.54±0.19

8.60±0.21b

8.56±0.15ab

9.25±0.07

9.34±0.14c

9.12±0.04c

注:同列同一日龄阶段数据肩标不同小写字母表示差异显著(P0.05) ,相同小写字母或无字母表示差异不显著(P0.05) 

由表4看出,14日龄,各组盲肠内乳杆菌数量与空白对照组差异不显著(P0.05)28日龄,冻干粉组、喷干粉组乳杆菌数量高于空白组,差异显著(P0.05),且整体效果较好, 42日龄, 组整体盲肠乳酸杆菌数量高于其他组,差异显著(P0.05),冻干粉组和喷干粉组与空白组差异不显著(P0.05),说明可能该基因工程乳酸菌菌粉在白羽肉鸡成长的前期对盲肠乳酸菌的数量具有一定的保护作用,但持续作用时间较短,不如大肠杆菌灭活疫苗的效用持久。2842日龄组的盲肠内肠杆菌的数量低于空白对照组和阴性对照组,均差异显著(P0.05) 组均与空白组差异不显著(P0.05),说明可能该基因工程乳酸菌对盲肠大肠杆菌增殖具有一定的抑制作用。

2.3基因工程乳酸菌对肉鸡直肠乳杆菌和肠杆菌的影响

5基因工程乳酸菌对肉鸡直肠乳酸杆菌和大肠杆菌数量的影响( lgCFU) /g

组别

乳酸杆菌

大肠杆菌

 14日龄

 28日龄 

 42日龄 

14日龄

 28日龄

 42日龄

7.6±0.03a

8.60±0.15a

8.8±0.03a

8.41±0.17

7.1±0.03a

8.32±0.19a

7.52±0.17a

8.45±0.22a

8.6±0.10a

7.57±0.29

7.47±0.02a

8.56±0.06a

7.69±0.12a

8.52±0.06a

8.7±0.04a

8.98±0.16

7.76±0.14a

9.15±0.08a

6.9±0.05b

8.29±0.14ab

8.33±0.13b

7.96±0.06

7.62±0.17b

7.95±0.10b

6.70±0.06b

8.28±0.18ab

8.48±0.16ab

6.53±0.22

7.11±0.12b

8.1±0.03b

7.91±0.14a

8.26±0.21ab

8.15±0.08b

8.53±0.01

8.35±0.16b

8.67±0.17b

6.18±0.17c

6.70±0.09c

7.64±0.02c

8.09±0.07

7.19±0.18bc

8.59±0.14c

6.78±0.19b

7.64±0..08b

8.15±0.03b

7.93±0.25

7.3±0.07bc

8.76±0.01c

7.63±0.06a

7.81±0.18b

8.53±0.12ab

8.6±0.07

6.95±0.21b

8.99±0.21c

7.61±0.12a

7.94±0.17b

8.23±0.07b

7.82±0.08

8.7±0.2c

9.2±0.05c

空白

7.97±0.15a

8.72±0.01a

8.9±0.15a

8.19±0.17

7.63±0.04c

9.17±0.24c

注:同列同一日龄阶段数据肩标不同小写字母表示差异显著(P0.05) ,相同小写字母或无字母表示差异不显著(P0.05)

由表5看出,整个试验期间,Ⅶ组直肠乳酸杆菌数量均低于其他实验组,差异显著(P0.05)2842日龄时,Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组直肠乳酸杆菌数量低于空白对照组,差异不显著(P0.05),但高于阴性组,差异显著(P0.05)。表明该基因工程乳酸菌可能对直肠乳杆菌的繁殖具有一定保护性,但作用效果不明显。2842日龄冻干菌粉组和喷干菌粉组中高浓度直肠内肠杆菌的数量菌低于阴性对照组,差异显著(P0.05)。结果表明,基因工程乳酸菌可以在一定程度上控制直肠内大肠杆菌的数量。

3.结论与讨论

3.1基因工程乳酸菌对肉鸡免疫器官指数的影响

脾脏是禽类最大的外周免疫器官,法氏囊是禽类特有的体液免疫器官,是体内产生抗体的主要器官参与全身的细胞免疫和体液免疫[3]。肝脏是一个独特器官,在抗原及抗原递呈作用下,肝脏可以引起免疫耐受或炎症的发生,也可以有效地调节正在进行中的免疫反应。肝脏含有天然免疫反应细胞,例如NK细胞及NKT细胞,这些细胞选择性地富集在肝脏,在抗御病原微生物侵袭的第一线免疫反应中发挥重要作用[4]。免疫器官的发育状态及机能强弱直接决定着禽类的免疫水平[5]。免疫器官脾脏和法氏囊相对重量增加,说明机体细胞的免疫机能增加。

本试验中,28日龄时,基因工程乳酸菌喷干粉2×106 cfu/g浓度组脾脏指数显著高于空白组和大肠杆菌灭活菌液组,分别高出80%63.6%,基因工程乳酸菌喷干粉2×105cfu/g组脾脏指数显著高于空白组和大肠杆菌灭活菌液组,分别高出40%27.2%28日龄时,基因工程乳酸菌喷干粉2×106 cfu/g浓度组法氏囊指数效果显著好于大肠杆菌灭活菌液组,高出46.7%28日龄时,基因工程乳酸菌喷干粉2×106 cfu/g浓度组肝脏指数显著低于大肠杆菌灭活菌液组。试验结果表明基因工程乳酸菌对白羽肉鸡法氏囊和脾脏的发育有促进的作用,对大肠杆菌引起的肝毒性有一定的保护性,其中尤以基因工程乳酸菌喷干粉2×106cfu/g浓度组效果较为明显。

3.2 基因工程乳酸菌对肉鸡肠道菌群的影响

王芳等[6]用含乳酸菌的益生素饲喂海兰褐蛋鸡,可以增加肠道乳酸菌量和减少大肠杆菌数量。胡顺珍[7]用含乳酸菌的复合微生态制剂饲喂健康肉鸡,14日龄和28日龄肉鸡盲肠乳酸菌数量显著高于对照组(P0.05),大肠杆菌数量显著低于对照组(P0.05)Jin[8]等发现肉仔鸡在1020 日龄饲喂0. 05% 乳酸杆菌混合物后盲肠大肠杆菌数显著降低。至没有关于基因工程乳酸菌作为微生态制剂在畜禽养殖方面的报道,本试验初步研究了基因工程乳酸菌在肉鸡养殖中,对肉鸡免疫器官指数和肠道菌群的影响,本研究表明,基因工程乳酸菌可以在一定程度上抑制直肠和盲肠中大肠杆菌的增殖,并且在肉鸡成长的前期对盲肠和直肠乳酸菌的数量具有一定的保护作用,但持续作用时间较短,不如大肠杆菌灭活疫苗的效用持久。

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