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富硒酵母液体深层发酵条件的研究
  作者: 摘自:山东宝来利来生物工程公司网站 日期:2012-01-29  
   摘要:本文对经含硒麦芽汁平板驯化得到的AS15菌株在含硒 (Se4+ )麦芽汁培养基中液体发酵条件进行研究。试验结果表明AS15菌株在含Se4+ 的液体培养基中生物量和硒转化率均高于出发菌株。在AS15菌株对数生长期添加亚硒酸钠,AS15菌株生物量及硒转化率优于其他添加方式。AS15菌株发酵罐培养采用恒pH发酵,生物量有了明显的提高,达13.41 g/L。在AS15菌株发酵罐培养22 h后进行定时加入Se4+,所得到的AS15酵母细胞内的硒含量较摇瓶发酵有所提高,达2081μg/g,硒的转化率达84.5%。
    关键词硒:富硒酵母;液体发酵

    硒是人体和动物必需的微量营养元素之一,是动物体内谷胱甘肽过氧化酶的活性成分,这种酶能清除动物细胞呼吸代谢中产生的过氧化物与羟自由基,维护生物膜的完整性,从而具有提高机体免疫力,有保护肝脏和抗衰老作用。随着生物医学技术的发展,微量元素硒作为一种人体必需的营养元素已引起人们的高度重视。在研究补硒时,人们常把硒的化合物分成有机硒和无机硒两大类,有机硒的生物活性较高, 能够有效地在体内同化, 且毒性比无机硒小, 又利于在生物体内吸收,是一种比较理想的微量元素营养强化剂[1]。
    生物富硒是获取有机硒的有效途径,目前,生物富硒的方法主要是微生物转化法。用于富硒的微生物有食用菌类、酵母类和益生菌类等,其中酵母是目前公认的最为理想的富硒载体。研究表明硒酵母产品用于防治疾病和作为饲料添加剂有着广泛的应用前景。
本试验对经含硒平板诱导驯化的AS15产朊假丝酵母菌株发酵特性进行了研究, 并与出发酵母菌株A7进行了富硒能力的比较。同时还对发酵过程中硒的添加方式、AS15菌株上罐培养进行了试验,为富硒酵母的发酵生产奠定了基础。
    1 试验材料
    1.1 菌种 产朊假丝酵母(Candida utilis)A7,为本公司保藏。
    1.2 培养基
    斜面培养基:葡萄糖2%、蛋白胨1%、酵母膏0.2%、磷酸二氢钾0.1%、pH值5.0,琼脂1.5%。
    液体种子培养基:采用麦芽汁培养基。取一份麦芽粉加5份水,在65℃水浴锅中保温3-4h,使其自行糖化,直至糖化完全(检查方法是取0.5ml的糖化液,加2滴碘液,如无蓝色出现,即表示糖化完全)
    发酵培养基:波美度为10的麦芽汁培养基。
    1.3 试验设备
    水浴锅、高压灭菌锅、超净工作台、电热恒温摇床、7升机械搅拌发酵罐、高速离心机、电热板、UV2000紫外分光光度计、冷冻干燥机。
    1.4 试剂
    亚硒酸钠、EDTA、氯化钾、氯酸钾、变色酸、盐酸苯肼、浓盐酸、浓硝酸、高氯酸,均为分析纯。
    硒标准溶液:按每1000ml水加入无水亚硒酸钠228g的比例配制成含硒4+10%的亚硒酸钠溶液,121℃灭菌30min,做成Se4+含量为10%的无菌亚硒酸钠溶液,备用。
    2 试验方法
    2.1 培养方法
    2.1.1 液体种子制作:采用500ml三角瓶,装入麦芽汁培养基100ml,115℃灭菌30min,冷却后接种,在28℃摇床200rpm培养24小时即为摇瓶种子。
    2.1.2 高生物量富硒酵母菌株的选育
    复壮原有的产朊假丝酵母A7,对复壮得到的菌株进行发酵。以A7 作为出发菌株,按文献[2]进行UV和高浓度硒逐级复合诱变,筛选一株生物量和总硒含量较高的菌株,并对其进行多次传代试验,以证明该菌株的高生物量和高富硒能力的稳定性。
    2.1.3不同Se4+添加时间对菌株富硒的影响
    采用三角瓶摇床发酵,在酵母不同生长时期添加亚硒酸钠标准溶液至设定Se4+浓度,接种量为8%,转速200 rpm,28 ℃条件下恒温摇床进行发酵培养。
    为考察在菌株生长不同时期添加亚硒酸钠对菌株生长及富硒的影响,本试验选择了在发酵初始0 h、对数生长期 22 h 及成熟期 28 h 这 3 个时间点向发酵液添加亚硒酸钠,至培养液中Se4+浓度为20μg/mL,46 h结束培养,测定其生物量及细胞内的硒含量。
    2.1.4  实验室发酵罐培养
    菌株生长曲线的测定:以8%的接种量接种于装有5.0L 培养基的7.0L机械搅拌发酵罐中,在28 ℃,初始转速为 200 rpm、罐压0.05Mpa下进行恒 pH 培养,pH值定为 5.0。本法是根据培养基 pH 的变化流加NaOH溶液,当 pH降低至4.0时,加入碱液使pH升高至5.0。发酵过程中每隔2 h时取样,测定发酵液的生物量。以酵母菌的生物量为纵坐标、培养时间为横坐标,绘出所筛选富硒产朊假丝酵母菌株的生长曲线。
    在酵母培养 22h 时添加亚硒酸钠标准液至发酵液中Se 4+浓度为10μg/mL,此后每隔3h流加同第一次等量的亚硒酸钠标准溶液,直至发酵液开始转红,立即停止发酵。
    2.2 测定方法
    2.2.1 生物量的测定:将发酵液 5 000 rpm离心10 min,收集菌体,蒸馏水洗涤两次,收集酵母菌体冷冻干燥后称重,即可得酵母生物量,以 g/L表示 。
    2.2.2 细胞内硒的测定及总硒的测定
    硒含量的测定:Se(Ⅳ)能够催化氯酸钾氧化盐酸苯肼生成偶氮离子,继而与变色酸偶联成红色偶氮染料。生成的红色偶氮染料的吸光度与一定浓度范围的硒成正比,利用紫外-可见分光光度计在520nm波长下测其吸光度,用标准曲线法即可求得硒的含量[3]。
    测定上述测定生物量后得到的干菌体的硒含量,即为酵母细胞内的硒。因富硒酵母细胞内的硒主要以有机硒的形式存在,其中的有机硒可占到其细胞内总硒的90%以上[4],所以本试验以酵母细胞内的硒含量作为衡量酵母所富集的有机硒多少的指标。
    硒总含量(μg/L)=酵母细胞内的硒含量(μg/g)×生物量(g/L)
    硒转化率(%)=硒总含量(μg/L) /添加硒的浓度(μg/L)×100%
    3 结果与分析
    3.1  AS15 菌株与出发菌株A7富硒能力的比较
    对原有的产朊假丝酵母A7进行UV和高浓度硒逐级复合诱变,筛选出一株生物量和总硒含量较高的菌株AS15,经过多次传代试验,证明该菌株的高生物量和高富硒能力的是稳定的。
    将AS15菌株和原始出发菌株A7接种到含 Se4+ 20μg/mL 的麦芽汁培养基中进行摇瓶培养,培养温度 28 ℃,摇床转速200rpm。在46 h终止培养,测定两菌株生物量和总硒含量、酵母细胞内硒含量及硒的转化率,结果见表1。
    表1   AS15菌株与原始菌株富硒能力的比较  


菌株

生物量(g/L)

总硒含量(μg/L)

酵母细胞内硒含量(μg/g)

硒转化率( %)

A7

16.9

6422

380

32.1

AS15

23.3

11253.9

483

56.3

    由表1 可知,AS15菌株在Se4+含量20μg/mL 的麦芽汁培养基培养所得生物量和总硒含量明显高于出发菌株。这表明A7菌株在Se4+含量20μg/mL的麦芽汁培养基上,生物量只有 16.9 g/L,而AS15 菌株在该培养基上表现出较好的生长能力和富硒能力,生物量达23.3 g/L,总硒含量达11253.9μg/L。AS15 菌株在摇瓶培养条件下硒的转化率为56.3%,比出发菌株提高75.4%,明显高于出发菌株。从发酵液的色泽来看,46 h时A7菌株发酵液色泽已转为红色;而此时AS15 菌株的发酵液色泽略呈微粉色。这是由于酵母在生长过程中吸收无机硒,经过生化反应将其转化为自身蛋白质组成部分,但酵母本身具有还原性,大量酵母成熟后,又可将发酵液中氧化态的四价硒还原为红色单质硒沉淀下来。由于这种单质硒和硒酵母混在一起,很难用物理方法分开,因此在硒酵母的生产中,为控制单质硒过多生成,常作为发酵结束时间的指标之一[4]。本试验结果表明,经筛选得到的AS15菌株在Se4+含量为 20μg/mL的麦芽汁培养基上有较好的生长及富硒能力,在 46 h时结束发酵可有效控制单质硒的生成。
    3.2 不同Se4+添加时间对AS15菌株富硒的影响
    在菌株AS15发酵初始0 h、对数生长期 22 h 及成熟期 28 h 这3个时间点向发酵液添加亚硒酸钠,至培养液中Se4+浓度为20μg/mL,46h结束培养。试验结果见表2。
    表2  不同 Se4+ 添加时间对AS15菌株生长及富硒情况的影响


添加时间
(h)

生物量
(g/L)

酵母细胞内硒含量(μg/g)

总硒含量
(μg/L)

硒转化率( %)

0

18.9

410.3

7754.7

38.8

22

25.6

451.6

11561.0

57.8

30

25.2

431.5

10873.8

54.4

    由表2可见,初始培养基中添加硒所得菌株的生物量最低,只有18.9g/L,这表明发酵液中 20μg/mL Se4+ 浓度在一定程度上还是会抑制菌株的生长,其硒的转化率也最低,只有38.8%。比较培养过程中加入无机硒的方式,在其对数生长期加 Se4+ 比在后期加Se4+ 更好。从所获得的酵母总硒含量测定来看,添加时间对Se4+的转化能力是有影响的。最佳方式为22 h加入 Se4+ ,其次是28 h 添加 Se4+ ,而在培养初始添加 Se4+ 所得的干酵母中含硒量最低。试验结果表明,在菌株培养 22 h 时添加Se4+效果最佳,生物量达 25.6 g/L,其酵母细胞内硒含量达451.6μg/g,总硒含量达11561.0μg/L,硒转化率达57.8 %。这说明随着酵母生长速度加快,进入对数生长期,酵母产量不断增加,富集硒的能力也逐渐增强,到了成熟期则有所减弱。所以在后续试验中我们确定在菌株对数期开始进行无机硒的添加,有利于获取较高的富硒酵母生物量和硒转化率。

    3.3  AS15 菌株在小型发酵罐中生长曲线的确定

 

    由生长曲线图1可以看出该菌株在15h进入对数生长期,在15-24h生物量迅速升高,至28 h生物量保持在一个相对稳定的数值,而后生物量呈缓慢下降趋势,进入了衰亡期。通过对菌株在液体培养基中的生长状况的研究,为后期AS15菌株培养过程中无机硒添加时间及培养时间的确定提供了依据。

    1.  AS15菌株发酵罐液体深层发酵

表3  上罐培养AS15菌株的生长及 Se4+ 转化


生物量
(g/L)

酵母细胞内硒浓度
(μg/g)

总硒含量
(μg/L)

硒转化率
(%)

32.5

2081

67632.5

84.5

    由表3可以看出,在发酵罐液体深层发酵中采用恒pH培养,可以获得较高的酵母生物量,达32.5g/L。发酵罐液体深层发酵试验表明,当发酵时间46 h时,发酵液的颜色刚开始转红,结束发酵。由于发酵罐培养较摇瓶培养通气等条件要好,且pH始终维持在酵母生长最适pH环境,故生物量有了极大的增长,因而本试验在20h 加亚硒酸钠至设定浓度后,每隔3h 进行了发酵液的补Se4+试验。至发酵终了,5 L 发酵液中流加入的 Se4+ 量达80μg/mL,酵母细胞内的硒达2081μg/g,硒转化率达84.5%。
    4 小结
    4.1  经诱变驯化的AS15菌株在含Se4+ 20μg/mL 麦芽汁培养基中能较好地生长,其富硒能力和生物量均明显优于出发菌株。
    4.2 摇瓶培养结果表明,AS15菌株在培养过程中加Se4+比在培养初始加Se4+可以获得更高的生物量和硒转化率。而比较菌株对数生长期加Se4+优于生长成熟期加Se4+,生物量可达25.6g/L,硒转化率可达57.8%。
    4.3 通过上罐发酵研究发现,采用恒pH培养,AS15菌株生物量有了明显的提高,达32.5g/L。在AS15菌株培养22 h 后进行分次流加亚硒酸钠溶液,所得到酵母细胞内硒含量较摇瓶发酵所得有显著提高,达2081μg/g,转化率达84.5%。
    参考文献
    [1]富硒酵母的选育及其发酵条件的优化试验,原国强,梁海秋,杨辉等,食品科技,2007(5):25-28.
    [2]强聚硒能力菌种的选育, 罗世炜,曾分有,史丽英等,湖北民族学院学报(自然科学版),2007 25 1:85-87。
    [3] 郝素娥 ,滕冰.硒酵母中硒含量测定方法的研究,理化检验——化学分册,1999,35(4):151-153
    [4]陆建安,李剑芳,袁信华等. 饲用硒酵母制备过程中硒梯度添加方法的研究.饲料与粮食工业,2003(1):37-38

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